تفاعل البلمرة المتسلسل Polymerase Chain Reaction (PCR)

تفاعل البلمرة المتسلسل

Polymerase Chain Reaction (PCR)

اهداف الدرس العملى :

1. يجب أن يكون كل طالب قد عرف ما هو تفاعل البلمرة المتسلسل PCR،
2.  الفرق بين تكرار DNA داخل الخلايا الحية وتكراره معمليا باستخدام PCR
3.  أهمية البادئ Primer وكيفية حساب عدد الجزيئات الناتجة بناءاً على عدد الدورات المستخدمة .
4. ماهى بعض مشاكل فى تفاعل الـ PCR .
5. ما هى استخدامات PCR وكيفية التطبيق العملي .
6.  معرفة مكونات تفاعل PCR وتحضير مخلوط التفاعل.

عناصر الدرس:

1.    معنى تفاعل البلمرة المتسلسل .

2.    الفرق بين تكرار الـ DNA فى الخلية وفى هذا الجهاز.

3.    تعريف كل مكون من مكونات الـ PCR .

4.    بعض استخداماته وبعض مشاكله وطريقة حلها .

تفاعل البلمرة المتسلسل PCR

    يعتبر تفاعل البلمرة المتسلسل PCR إحدى تقنيات علم الأحياء الجزيئي Molecular Biology والتي تستخدم في إكثار قطعة محددة من DNA (جين أو جزء من جين أو تتابع معين من DNA) لملايين ومليارات المرات في ساعات محدودة (2- 4 ساعات) داخل المعمل   in vitroمحاكيا في ذلك التكرار الطبيعي لجزئ DNA داخل الخلية الحية in  vivo مع بعض الاختلافات.

تكرار DNA :

    تقوم الخلية الحية بتكرار محتواها من المادة الوراثية DNA من أجل التمهيد للإنقسام الخلوي إلى خليتين (كما في الإنقسام الميتوزي Mitosis والانقسام المباشر Amitosis في الخلايا مميزة النواة والانشطار الثنائي Binary fission في الخلايا الغير مميزة النواة) ويتم ذلك باستخدام الإنزيمات ومجموعة من البروتينات حيث يتم فصل شريطي DNA عن بعضهما لتكوين ما يعرف بالقالب Template ثم تتحد قطعة صغيرة من RNA (البادئ Primer) مع أحد الخيطين المفردين من DNA، يلي ذلك بناء جزء مكمل للخيط المفرد (القالب) إعتمادا على البادئ (قطعة (RNA  باستخدام إنزيم بناء .DNA

أهمية البادئ Primer:

    تحتاج إنزيمات بناء DNA (DNA polymerase) إلى قطعة صغيرة من RNA أو DNA تعمل كبادئ من أجل بناء DNA حيث لابد من توافر مجموعة هيدروكسيل (OH) حرة على الطرف 3´ لسكر دي أوكسي ريبوز ليقوم إنزيم بناء DNA بإضافة القواعد النيتروجينية إليها من أجل بناء DNA بينما لا تحتاج إنزيمات بناء RNA إلى وجود البادئ حيث يمكنها بناء RNA مباشرة على قالب من DNA بدون الحاجة إلى وجود مجموعة الهيدروكسيل (OH) الحرة ولهذا السبب يتم بناء DNA داخل الخلية الحية باستخدام بادئات من RNA -  بينما يستخدم بادئ من DNA (يتم تخليقه صناعيا بجهاز DNA Synthesizer) في تفاعل .PCR

الفرق بين تكرار DNA داخل الخلية وتخليقه داخل PCR

    يتم تخليق نسخة واحدة داخل الخلية بينما يتم تخليق ملايين ومليارات النسخ باستخدام PCR ولهذا يطلق مصطلح التضخيم (التكبير) Amplification على ناتج PCR بدلا من التكرار Replication الذي تقوم به الخلية الحية طبيعياً.

تقوم الخلية بتخليق نسخة كاملة من DNA لكامل الجينوم بينما يعمل PCR على جزء محدود فقط من الجينوم قد يكون جينا أو جزءً من جين.

تَستخدم الخلية بادئا من RNA يتم إزالته فيما بعد بينما يستخدم PCR بادئا من DNA المخلق صناعيا.

تستخدم الخلية مجموعة من البروتينات والإنزيمات لبناء DNA حيويا بينما يستخدم إنزيم واحد فقط (إنزيم بناء DNA) في PCR ويستعاض عن باقي الإنزيمات والبروتينات باستخدام الحرارة بدلا من ذلك.

PCR - الفكرة العامة:

    تستخدم الحرارة لفصل شريطي الـ DNA (القالبين) واتحاد القالب مع البادئ إعتمادا على أن الروابط الهيدروجينية هى التي تربط شريطي DNA معا وهي روابط ضعيفة يسهل كسرها برفع درجة الحرارة ويعاد تكوينها من جديد بخفض الحرارة ويتم ذلك على النحو التالي:

·        يتم فصل الشريطين برفع الحرارة إلى 94^◦م.

·        يرتبط القالب مع البادئ على درجة حرارة تتوقف على نوع البادئ المستخدم وتتراوح من 37 إلى 65^◦م.

·        يبدأ الإنزيم في بناء DNA ويصل لأقصى نشاط له عند 72^◦م.

·        ويتم تكرار هذه الخطوات الثلاث أكثر من مرة تسمى كل منها دورة.

 ويتوقف عدد جزيئات DNA الناتجة على عدد الدورات المستخدمة ويتم حسابها طبقا للمعادلة التالية: عدد جزيئات DNA الناتجة = عدد قوالب DNA المستخدمة × 2 ^{عدد الدورات المستخدمة}  . وعلى هذا بفرض أننا بدأنا التفاعل باستخدام 5 قوالب من DNA (5 جزيئات مزدوجة الخيوط من 5 خلايا مثلا) وكررنا التفاعل 30 دورة فإننا نحصل على عدد من جزيئات DNA الناتجة يساوي 5 × 2 ³⁰   أي أكثر من خمسة مليارات نسخة.

بعض استخدامات PCR:

هناك استخدامات كثيرة لفكرة تفاعل البلمرة المتسلسل PCR منها:

·   تشخيص الأمراض التي تتسبب عن العدوى بمسبب مرضي حى (بكتريا أو فيرس مثلا) كالإلتهاب الكبدي الوبائي والإيدز.

·   تشخيص الأمراض الوراثية (تنتج عن وراثة الفرد لجين ممرض من أحد أو كلا الوالدين) حتى إن كان الفرد لا يظهر عليه المرض (يحمل الجين الممرض بحالة خليطة) مثل أنيميا الخلايا المنجلية.

·        تطبيقات الطب الشرعي المختلفة مثل تحديد الجناة في الجرائم وإثبات الأبوة.

·        عمل البصمة الوراثية للأصناف النباتية والعشائر الحيوانية المختلفة.

·        دراسة العلاقات التطورية .

ý   بعض مشاكل عملية الـ PCR  : 

1.    اذا كان تفاعل العملية كان يعمل من قبل والان لم يعطى معك اى نتيجة ؟؟ ماذا يمكن ان نفعل ؟؟

·        لابد من التاكد من كل مكون من مكونات الـ PCR الداخلة فى التركيب (buffers – Taq – template )

·       يمكنك تغيير محلول الـ dNTP ( وذلك لانه حساس لدرجة الذوبان والتجميد خصوصا فى الـ Multiplex PCR .

·       اذا كان لديك الـ Primer  جديد لابد من التاكد من انه يمكن الاعتماد عليه واعطاء نتائج

·       ممكن علاج هذة المشكلة عن طريق زيادة كمية الـ Primer

·       ممكن علاج هذة المشكلة عن طريق زيادة كمية الـ Template

·       ممكن خفض درجة الحرارة مرحلة الـ Annealing  الى 6 - 10 C  ثم مراقبة المنتج.

2.    اذا كان الناتج الـ PCR ضعيف ماذا يمكن ان تفعل لزيادة المحصول او الناتج ؟؟

·        خفض درجة حرارة الـ Annealing تدريجيا لاقل درجة ممكنة

·        زيادة كمية الـ Primer – or Template – or Taq  

·   تغيير تركيز محلول الـ Kcl   ( اعلى لو كان المنتج اقل من الـ 1000 bp  واقل لو كان المنتج اكبر من الـ 1000 bp )

·        فحص تتابع الـ Primer   وذلك لانه ممكن ان يكون به خطأ و / او زيادة فى الطول عن طريق زيادة 5 نيوكليوتيدات .

3.  اذا كان لديك بادئين مختلفين فى درجة حرارتهم  ولايمكنك تغييير مكانهم كيف يمكن تحسن عملية الـ PCR والحصول على تضخيم للـ DNA ؟؟

·   زيادة طول الـ Primer  بخفض درجة الحرارة (Tm)   حيث اذا كنت محتاج ان تحافظ على حجم المنتج ثابت اضف قليل من القواعد عند النهاية 3"

·        اذا كان الحجم غير مركز اضف قليل من القواعد عند النهاية اما 3" او 5" للبادىء

4.  اذا كان لديك اكثر من بادىء يحدث بينهم تزاوج وانت تريد العمل بيهم . كيف يمكن استخدامهم مع بعض ؟ وكيف يمكن عمل خليط منهم فى الـ PCR ؟؟

·        حيث من الممكن جدا ان يحدث ذلك ولمحاولة تضخيم المواقع يكون بشكل مستبعد استخدام نفس برنامج الـ PCR حيث انه لو ان واحد من البادئات تزاوج يكون المنتج غير محدد . لذلك لابد من المحافظة على حالات الدورة ثابتة وتغيير مقاييس ارخى ذكرت من قبل .

5.    اذا كان ناتج الـ multiplex reaction لديك كان ضعيف ماذا يمكن ان نفعل لتحسين المحصول ؟؟

·        خفض درجة حرارة مرحلة الـ Extension  الى  62-68 C او عن طريق زيادة وقتها .

·        تغيير تركيز محلول الـKcl  ولكن نحافظ على تركيز الـ  Mgcl₂ ( 1.5 – 2 mM )

·        قد يمكن زيادة تركيز الـ Mgcl₂ الى (3 – 4.5 mM ) ولكن مع الحفاظ  على تركيز الـ dNTPs ثابتة .

ý   التطبيق العملي للـ PCR  :

يتطلب إجراء تجربة PCR المكونات السبعة التالية:

المادة	فائدتها
جزئ DNA الأصلي (الجينوم الكامل) :	والذي يستخدم كقالب Template لبناء خيوط من DNA باستخدام تفاعل .PCR
البادئ Primer :	الذي يحدد المنطقة (الجين) التي سيتم بناءها باستخدام PCR *وتتطلب التجربة الواحدة وجود بادئين أحدهما أمامي Forward يحدد بداية المنطقة (الجين) وآخر خلفي Reverse يحدد نهاية المنطقة* وجدير بالذكر أن قطعة DNA الناتجة في تجربة PCR تبدأ بأول نيوكليوتيدة في البادئ الأمامي وتنتهي بآخر نيوكليوتيدة في البادئ الخلفي.* أيضا فإن القالب الواحد من DNA يمكن أن يستخدم في أكثر من تجربة PCR وتختلف النتائج في كل تجربة منها تبعا للبادئ المستخدم في كل مرة.
إنزيم البناء DNA polymerase :	ويستخدم في تفاعل PCR أنواع معينة من إنزيمات بناء DNA تتميز بثباتها الحراري Thermo-stable enzymes حيث يمكنها احتمال الحرارة العالية (94◦م) وأداء الدور المطلوب منها ومن أكثر هذه الأنواع استخداما إنزيم Taq polymerase والمعزول من بكتريا Thermus aquaticus (كلمة Taq جاءت من حرف T من اسم الجنس وحرفي aq من اسم النوع) وتعيش هذه البكتريا في الينابيع الحارة ولذلك تمتلك الإنزيمات المعزولة منها قدرة عالية نسبيا على العمل في ظروف الحرارة العالية.
القواعد النيتروجينية (النيوكليوتيدات) Nucleotides :	والتي تعتبر بمثابة أحجار البناء عند بناء DNA حيث بارتباطها بالنهاية 3´ للبادئ تكوِن شريط DNA الجديد، وتضاف النيوكليوتيدات في تفاعل PCR على هيئة نيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) تحتوي على سكر دي أوكسي ريبوز deoxyribose (من هنا جاء حرف d الصغير قبل اسم النيوكليوتيدة بينما ترمز TP إلى كونها ثلاثية الفوسفات Tri-phosphate).
أيونات المغنسيوم الثنائية Mg+2 :	والتي تعمل كمرافق إنزيمي لإنزيم البناء وتضاف على هيئة كلوريد مغنسيوم MgCl2.
محلول منظِم Buffer	يضبط درجة الحموضة pH عند المستوى المناسب لتفاعل بناء DNA ويحتوي على بعض المواد التي تحسن من أداء إنزيم البناء.
الماء النقي المعقم :	وهو الوسط المناسب لحدوث التفاعلات الحيوية ويضاف في تجربة PCR لضبط الحجم النهائي لمخلوط التفاعل تبعا للكميات المستخدمة من كل مكون من المكونات الستة السابقة والتي قد تختلف من تجربة لأخرى تبعا لاستخدام مصادر مختلفة للكيماويات قد تختلف في تركيزاتها من شركة لأخرى.

الأسئلة:

1-    ما هى درجات الحرارة المستخدمة في PCR ودور كل منها؟

2-    ما الفرق بين تكرار DNA حيويا ومعمليا باستخدام PCR؟

3-    وضح أهمية البادئ في PCR؟

4-    ما دور كل من المكونات التالية في تجارب PCR؟

  القالب – البادئ – إنزيم Taq polymerase – Mg⁺² – المحلول المنظم – dNTPs.

5-    أذكر بعض تطبيقات PCR؟