🔷طريقة الاليزا (ELISA)🔷
( Enzyme linked immunsorbent assay).
🌹د.عبدالرؤوف البرعي🌹
🔷طريقة الاليزا:-
تستخدم هذه الطريقه بصورة كبيرة فى تحاليل المناعة والهرمونات وكذلك الفيروسات.
🛑فكرة الاختبار:-
تعتمد فكرة هذه الطريقة على معلومة هامة فى علم المناعة وهى فكرة المناعة المتخصصة والتى تتلخص فى أنه عند دخول جسم غريب الى جسم الانسان (فيرس معين مثلا ) يقوم جهاز المناعة بتكوين أجسام مضادة مناعيه ضد انتيجينات هذا الجسم الغريب وتظل موجودة فى الجسم فيما يسمى الذاكرة المناعية , تكون هذه الاجسام المضادة خاصة للأنتيجين الذى تكونت من أجلة فقط ومن هنا تأتى الفكرة فعندما نريد أن نبحث عن انيجين أو فيرس معين فى عينة لشخص ما نأتى بالاجسام المضادة المتخصصة له فترتبط به والعكس صحيح.
🛑وفيها يتم استخدام أجسام مناعية موصومة (مرتبطة) "labeled" بإنزيم معين يمكن الكشف عنه بسهولة بشرط ألا يؤثر هذا الارتباط على نشاط أي من الأجسام المناعية أو الإنزيم.
🛑وهناك أنواع من الإنزيمات تستعمل لهذا الغرض منها: Alkaline phosphatase, HRPO (horseradish peroxidase)
👈🏻ويمكن التعرف على الإنزيم باستعمال الركيزة (substrate) الخاصة به في وجود مادة تتلون عند أكسدتها.
ونظراً لسهولتها و أمانها فإن اختبارات الإلايزا تستعمل على نطاق واسع في المجال التشخيصي و هناك المئات من أطقم التشخيص التي تعتمد على الإليزا لتشخيص أمراض الحيوان الفيروسية، البكتيرية، والطفيلية.
شرح طرق القياس الكيميائى ( طريق الاليز) وهما طريقتان:-
🛑أولا الطريقه المباشرة (Direct Elisa)
( direct, capture or sandwich ELISA).
🛑ثانيا الطريقه الغيرمباشرة(InDirect Elisa)
indirect or competitive ELISA).
🛑الطريقه المباشرة (Direct Elisa)
( direct, capture or sandwich ELISA).
👈🏻تعتبر من احدى الطرق التى تستخدم لتحديد نسبة انتيجين مجهول فى العينة (اى الميكروب نفسه).
👈🏻🛑 فكرة عملها :
فيتم تثبيت أجسام مضادة معروفة في فتحات الطبق ثم الكشف عن الأنتيجين الخاص بهذه الأجسام المضادة في العينة بإضافة العينات إلى الفتحات وتركها فترة للتفاعل. بعد الغسيل بمحلول فوسفات فسيولوجي يتم إضافة نفس نوع الأجسام المضادة ولكنه مرتبط بالإنزيم ويتبع ذلك غسيل ثم إضافة الركيزة و إكمال الاختبار كما هو الحال مع الإلايزا غير المباشرة.)
👈🏻 طريقة عمل الطريقه المباشرة
(Direct Elisa or sandwich ELIsa)
1- فى الطريقة المباشرة نبحث عن أنتجين مجهول
2- تكون جدران الويلات مغطاة بالاجسام المضادة الخاصة بالانتيجين المراد الكشف عن وجودة
3- عند اضافة العينة الى الويل تقوم الاجسام المضادة الموجودة على جدران الويل بالارتباط بالانتيجن اذا وجد فى العينة
4- يتم غسيل الويل للتخلص من الاجسام المضادة غير المرتبطة والانتيجنات الاخرى الغريبة ويتبقى الانتجين المطلوب مرتبط بالجسم المضاد الوجود على جدار الويل
(antibody antigen complex) يسمى الجسم المضادالمرتبط بالانتجين (معقد الانيجين والجسم المضاد
5- يتم اضافة جسم مضاد أخر يكون مميز او معلم بواسط انزيم يتفاعل هذا الجسم المضاد الثانى مع معقد الانتيجين والجسم المضاد
6- تكرر عملية الغسيل مرة أخرى للتخلص من الاجسام المضادة غير المرتبطة
7- يتم اضاف الخطوة الاخيرة وهو مركب (substrate or tmb) يقوم الانزيم المرتبط فى الجسم المضاد الثانى بتحويلة من مادة عديمة اللون الى لون.
6- بعد ذلك يتم وضع محلول لوقف التفاعل يسمى (Stop solution)
7-يتم القراءة على جهاز قراءة الاليزا عند الطول الموجى المناسب.
👈🏻تتناسب قوة امتصاص هذا اللون مع تركيز الانيجين المجهول فى العينةويأتى مع كل كيت اليزا عدة استاندرات- محاليل قياسيه (6 غالبا) بتركيزات متدرجة معلومة يتم عمله مع الاختبار المطلوب ثم يتم رسم منحنى قياسى يمثل العلاقة بين قوة التركيزconcentration الامتصاصabsorbance
ويتم حساب النتائج من هذا المنحنى.
🛑ثانيا الطريقه الغيرمباشرة(InDirect Elisa)
indirect or competitive ELISA)
:- وهى تحديد نسبة أجسام مضادة فى العينة. (مضادات الميكروب)
🛑* طريقة الاليزا المباشرة Direct Elisa
فى الاليزا عادة نستخدم أطبافق الاليزا وهو طبق مكون من صفوف وكل صف مكون من 8 ويلات (نقرات) وعاة يكون الطبق 96 ويل.
👈🏻🛑فكرة طريقة عمل الاليزا المباشرة Direct Elisa:
ففي الإاليزا غير المباشرة، على سبيل المثال، يتم تثبيت أنتيجين معروف لميكروب معين في فتحات طبق بوليستيرين (يتم ذلك في وجود محلول كربونات/بيكربونات صوديوم عند pH 9.6 لمدة ساعة بالحضانة أو ليلة بالبراد).
Dr
14:51
يتبع ذلك إضافة عينات الأمصال بتخفيف معين بالإضافة إلى عينات ضابطة ويترك الطبق لمدة 30 دقيقة ليتم التفاعل.
بعد الغسيل يتم إضافة مضاد النوع المرتبط بالإنزيم (يشترى) بتخفيف معين ويترك الطبق لمدة 30 دقيقة.
بعد الغسيل يتم إضافة الركيزة مع مادة قابلة للتلون ثم يترك الطبق لمدة 10-15 دقيقة في مكان مظلم بعدها يتم إيقاف التفاعل بتغيير الـ pH باستعمال حمض مخفف. يتم قراءة شدة اللون بالعين أو باستخدام جهاز قراءة طيفي (ELISA reader) حيث تكون هناك علاقة طردية بين كمية الأجسام المضادة بالعينة و شدة اللون.
🛑* خطوات طريقة الاليزاغير المباشرة In Direct Elisa:
نفس خطوات الاليزا المباشرة ولكن فى هذه الطريق نبحث عن الاجسام المضادة المجهولة فى العينة فتكون العكس جدران الويلت مغطاة بالانتيجنات الخاصة بالاجسام المضادة المراد الكشف عنها وباقى الخطوات هى نفسها ولعل اشهر الامثلة لهذا النوع الاليزا الخاصة بالكشف عن الاجسام المضادة بفيروس (C الكبدى).
🛑 هناك أنواع مختلفة من اختبارات الإاليزا تختلف أسماؤها باختلاف الطريقة ولكن في النهاية تتم القراءة بنفس الكيفية مثلا :
👈🏻 أنواع الاختبارات لفحص الايدز:
ان أكثر اختبارات الأجسام المضادة شيوعا هو اختبار ELISA و اختبار Rapid test، أما اختبار Western Blot أقدر على تشخيص حالة عدم الإصابة بالفيروس من غيره من الاختبارات إلا انه أيضا أكثر كلفة.
👈🏻اختبارات الأجسام المضادة:هذا النوع من الاختبارات يكشف عن الأجسام المضادة مثلا لفيروس مثل المسبب لنقص المناعة البشريه الايدز و لا يكشف عن وجود الفيروس نفسه، فعندما يغزو فيروس(الإيدز) المسبب نقص المناعة البشرى الجسم يدخل في خلايا CD4 اللمفاوية و هي إحدى فئات كرات الدم البيضاء، فيرد جهاز المناعة على هذا الغزو بإنتاج الأجسام المضادة لمحاربة العدوى ، و تعتمد اختبارات الأجسام المضادة على الكشف عن وجود هذه الأجسام كدليل على وجود الفيرس.
🛑
2) التألق المناعي (Immunofluorescence) = Fluorescence antibody technique "FAT"
كما هو الحال في الإلايزا فإنه في اختبار التألق المناعي يتم استخدام أجسام مضادة مرتبطة ولكن ليس بإنزيم وإنما بمادة تسمى (fluorochrome )و هي مواد كيميائية تم..
إنشاء الله أكون اقدرت بجمع الخطوات الأساسية لعمل الإاليزا .(ELISA methods)
🌹د.عبدالرؤوف البرعي 🌹
Dr
Comments
Post a Comment
اكتب تعليق حول الموضوع