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Introdução

O termo cultura de tecidos vem sendo empregado de forma genérica, sendo utilizado para se referir aos estudos com

células ou órgãos mantidos in vitro por mais de 24 h. A cultura de órgãos refere­se ao cultivo de fragmentos ou de um

órgão completo, com a manutenção da sua estrutura tecidual tridimensional e das funções integrais ou parciais que eram

exercidas in vivo, enquanto a cultura de células se refere a células mantidas in vitro, provenientes de desagregação

mecânica, química ou enzimática de um tecido ou órgão.

Breve histórico

O estabelecimento de técnicas para manter e cultivar células in vitro é um marco importante na evolução das Ciências

Biológicas. Desde a sua introdução em 1907, métodos têm sido desenvolvidos para elucidar questões fundamentais da

biologia celular e direcionar pesquisas na área da saúde.

A história do desenvolvimento do cultivo celular teve início com o pioneirismo de Ross Granville Harrison com o

objetivo de melhor compreender o sistema nervoso. Seus experimentos consistiam em colocar um fragmento de medula

espinal de embriões de anfíbios em linfa, vedada entre uma lamínula e uma lâmina de vidro, o qual permitiu acompanhar

por até uma semana o crescimento e a formação de fibras nervosas, identificando como ocorria a inervação dos órgãos em

direção ao sistema nervoso central.

1 Outro importante pesquisador, laureado com o prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina

em 1912 por aprimorar a técnica de cultivo celular observando os estudos realizados por Harrison, foi Alexis Carrel, que

implantou modificações inovadoras para a época no controle rígido da assepsia e na troca periódica do meio de cultura,

sendo considerado por muitos pesquisadores o descobridor da técnica de cultivo celular em virtude de seu sucesso com

células cardíacas de embrião de galinha por aproximadamente 4 semanas.

2

,

3

Neste contexto, Albert Eberling, um dos assistentes de Carrel, desenvolveu a técnica de subcultivo de células do coração

de embrião de galinha, repetindo o processo por 34 anos e criando a lenda do coração imortal de galinha. A desagregação

das células de explante (fragmento de tecido retirado de um órgão) por tripsina (enzima que age na quebra de proteínas) e o

posterior plaqueamento das células dispersas em garrafas de cultivo foram demonstrados pela primeira vez por Peyton

Rous e Fred Jones em 1916.

2

,

3

Em 1923, Carrel desenvolveu os primeiros frascos de cultura, circulares e de vidro. Em 1948, Keilova introduziu o uso

de antibióticos para a manutenção das culturas. Somente na década de 1950 a tripsina se tornou amplamente utilizada para

expansão de subculturas, seguindo procedimentos descritos por Dulbecco em culturas em monocamada para facilitar as

clonagens de células por ensaios virais. Os primeiros modelos tridimensionais testados por Joseph Leighton surgiram em

1951, com intuito de minimizar as limitações de um cultivo celular em monocamada e aproximá­lo da estrutura observada

em um organismo vivo.

1,2,4

George Gey apud Collins, em 1952, estabeleceu uma linhagem contínua de células derivadas de um câncer de cérvice

humano, retiradas de uma mulher afro­americana de 31 anos chamada Henrietta Lacks, atualmente conhecida como a

■

linhagem HeLa. Utilizada até hoje em todo o mundo, demonstrou que tumores humanos apresentam características

heteroaploides, em que o número de cromossomos varia de uma célula para outra, o que aumentou ainda mais o interesse

pelo cultivo celular.

5

Eagle e Dulbecco et al. apud Alberts et. al e Cruz et al., em 1955, fizeram a primeira investigação sistemática dos

nutrientes essenciais para o cultivo celular e descobriram que células eucariotas poderiam se propagar em uma mistura de

aminoácidos com uma pequena proporção de proteínas séricas, desenvolvendo a base dos meios de cultura utilizados

atualmente. Em 1961, Hayflick e Moorhead apud Alberts et al. e Cruz et al. mostraram que fibroblastos humanos em

cultura continham um número finito de divisões celulares. Desse modo, muitas linhagens foram estabelecidas por

pesquisadores com o intuito de desvendar os processos individuais de cada sistema. Em 1962, Nakamura et al. apud

Alberts et al. e Cruz et al. estabeleceram a linhagem VERO, oriunda de rim de macaco­verde africano

(Cercopithecusaethiops), que se tornou um excelente modelo para o desenvolvimento de vacinas aprovadas pela

Organização Mundial da Saúde (OMS).

1

,

6

Graham e van der Eb apud Robertis e Evans et al., em 1973, desenvolveram um método para introdução de DNA

humano em culturas de células de ratos. Já Köhler e Milstein apud Robertis e Evans et al., em 1975, produziram o

primeiro hibridoma de linhagens celulares capazes de secretar anticorpos monoclonais. Enquanto, em 1976, Hayashi e Sato

apud Robertis e Evans et al., mostraram que cada tipo celular necessita de uma mistura diferente de hormônios e fatores de

crescimento para se desenvolverem em um meio não suplementado. A partir dos anos 1980, grandes progressos foram

observados no cultivo celular para confirmar a importância dessa metodologia, na qual foram identificados por Evans et al.

em 1983 alguns dos principais reguladores do ciclo celular.

2

,

7

Incentivados inicialmente pelos estudos de Martin et al. apud Freshney em 1986, os estudos em cultivo celular também

identificaram células com grande potencial de diferenciação, em que células­tronco embrionárias pluripotentes de

camundongos foram isoladas e cultivadas. Células­tronco mesenquimais de humanos adultos e embrionárias foram

isoladas e cultivadas por Caplan, em 1991, e Thomson et al. apud Freshney, em 1998, respectivamente.

8

Com a evolução da Medicina e das tecnologias de informação, as pesquisas no campo científico foram sendo ainda mais

incentivadas a partir dos anos 2000. O Projeto Genoma Humano reuniu esforços internacionais para o mapeamento do

genoma da espécie humana e a identificação de todos os nucleotídeos que o compõem. Após iniciativa dos Institutos

Nacionais da Saúde (NIH) dos EUA, centenas de laboratórios de todo o mundo se uniram à tarefa de sequenciar, um a um,

os genes que codificam as proteínas do corpo humano e também aquelas sequências de DNA que não são genes.

As tecnologias em cultivo celular também foram adotadas em muitas aplicações de rotina em Medicina e na indústria. A

análise cromossômica de células derivadas de placenta coletadas por amniocentese pôde identificar doenças genéticas em

bebês durante o seu desenvolvimento uterino. Efeitos tóxicos de compostos farmacêuticos e o potencial de poluentes

ambientais puderam ser medidos em ensaios in vitro. Da mesma forma, produtos celulares, como o hormônio de

crescimento humano, a insulina e a interferona, agora são produzidos rotineiramente por células modificadas com genes

específicos. Aplicações em fertilização in vitro também foram desenvolvidas a partir de experimentos em cultura de

embriões, agora amplamente utilizados em muitos países. Além disso, o desenvolvimento de gametas in vitro a partir da

cultura de células germinativas primordiais, isoladas em testículos e ovário ou a partir de células­tronco embrionárias, tem

sido alvo de estudos.

Avanços substanciais foram observados ao longo dos anos, e, atualmente, estudos têm sido direcionados para a avaliação

do perfil proteômico e metabolômico dos organismos. De uma forma interessante, ações inovadoras têm sido exploradas na

engenharia de tecidos com a aplicação da bioimpressão automatizada de tecidos e órgãos humanos baseada na estruturação

por blocos de construção conhecidos como esferoides teciduais, utilizando impressoras 3D, em que esferoides contendo

células vivas sofrem um processo de fusão natural e o tecido/órgão recém­fabricado é levado a um sistema de cultivo que

deverá prover as condições necessárias para a maturação do novo órgão antes de este ser implantado no paciente.

Desse modo, a cultura celular não permite somente a avaliação direta, independente e restrita de um único tipo celular,

mas também é possível observar a interação célula­célula e sua importância no organismo.

Classificação das culturas celulares

As culturas celulares podem ser classificadas quanto ao tipo de ancoragem das células, podendo ser aderentes ou não

aderentes e, quanto à sua origem e o número de divisões celulares, como cultura primária ou de linhagem contínua.

Células aderentes e não aderentes

Dependendo do tecido de origem, as células podem crescer tanto suspensas no meio de cultura quanto aderidas, formando

monocamadas em superfície sólida. Na cultura em monocamada, as células aderem ao substrato, pré­requisito

■

■

indispensável à proliferação celular. O frasco de cultivo deve ser tratado por ionização para estimular o processo de adesão

celular, cuja produção de integrinas, proteoglicanos, microfilamentos, moléculas de adesão (CAM) dependentes ou não

dependentes de cálcio e outros interagem com o citoesqueleto celular, promovendo a ligação célula­célula e célulaarcabouço.

O crescimento em monocamada é observado na maioria das culturas de células normais com exceção das células

provenientes do tecido hematopoético, de tecido tumoral em processo de metastatização e aquelas circulantes oriundas do

sistema imune, cujas células crescem em suspensão de células individuais não aderidas ou em esferas (Figura 10.1).

Figura 10.1 Imagens de células em cultivo. A. Células de cultura primária de fibroblastos provenientes de explante de

tumor mamário canino (indicado pela seta). B. Células aderentes em monocamada da linhagem tumoral mamária canina,

CMT­U229, cedidas pela Dra. Eva Hellmén da Universidade de Uppsala, Suécia. C. Células em suspensão provenientes da

linhagem MDA­MB­231 para formação de mamosferas, obtida pelo banco de células ATCC. D. Mamosferas da linhagem

CMT­U229. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

Células primárias

As células primárias são obtidas diretamente de organismos vivos, em que o tecido separado em condições assépticas é

fragmentado em pequenos pedaços e submetido a um tratamento enzimático (tripsina, colagenase, elastase, hialuronidase e

outros) ou mecânico para dissociar­se dos agregados celulares e gerar uma suspensão de células livres, devendo ser

cultivado em recipiente e meio de cultura apropriados. Com a proliferação celular e o aumento do número de células, as

culturas primárias necessitam ser subcultivadas ou repicadas. Apesar disso, esse tipo celular permite um número limitado

de divisões, sem grandes alterações morfológicas.

Um dos principais desafios na realização da cultura primária a partir de tumores caninos é a manutenção de um cultivo

sem contaminação, uma vez que a maioria dos tumores desses animais é retirada cirurgicamente após um longo período de

evolução clínica e se apresenta ulcerada e contaminada, o que será um grande fator limitante no estabelecimento do cultivo

celular.

Células transformadas ou de linhagem contínua

À medida que o cultivo primário é subcultivado e as células mais resistentes sobrevivem aos processos de repique e

senescência, as células com maior capacidade proliferativa predominam no cultivo, mantendo as características do tecido de

origem em células mais homogêneas, com alto índice de proliferação. Obtém­se dessa forma uma linhagem celular por

subcultivo de uma cultura primária na qual, por seleção de uma mutação aleatória, as células são transformadas ou

imortalizadas, dando origem a uma linhagem celular contínua. Este tipo celular frequentemente está relacionado com a

tumorigênese e pode ser propagado sem perder suas características por inúmeras vezes.

Algumas células desenvolvem essa capacidade proliferativa pelo aumento da expressão de uma enzima chamada

telomerase, que tem a função de adicionar sequências específicas e repetidas de DNA à extremidade 3 dos cromossomos,

onde se encontra o telômero. A presença da sequência telomérica garante o anelamento da telomerase, que, por sua vez,

permite a replicação completa do cromossomo e sua correta distribuição espacial. Nas células normais, é natural que o

telômero diminua de tamanho durante seu ciclo de vida, em uma taxa de 30 a 120 pares de base por replicação, sendo esse

um sinal de senescência. Nas linhagens celulares imortalizadas, o comprimento dos telômeros varia com o tempo,

revelando uma atividade compensatória da telomerase.

Diversos são os mecanismos que potencializam e transformam células em linhagens contínuas por meio de técnicas de

introdução de genes virais transformantes, ligados a sequências de oncogenes, ou inativação dos mecanismos de ponto de

checagem que detêm o ciclo celular.

Linhagens celulares muitas vezes podem ser mais facilmente geradas a partir de células de câncer, mas essas culturas

diferem daquelas preparadas a partir de células normais de várias maneiras, sendo referidas como linhagens de células

transformadas. Essas linhagens frequentemente crescem sem aderir a uma superfície e podem proliferar para uma

densidade muito mais alta em uma placa de cultura. São extremamente úteis na pesquisa celular, como fonte de um grande

número de células de um tipo uniforme, especialmente por poderem ser estocadas em nitrogênio líquido a –196 °C por um

período indefinido e manter sua viabilidade quando descongeladas.

Tanto as linhagens celulares comercializadas quanto as cedidas ao laboratório de pesquisa por doação devem ser

caracteriza­ das com marcadores específicos, a fim de confirmar sua origem, seu fenótipo, seu grau de invasividade e a

proliferação celular para futuras aplicações.

Os bancos de células são empresas responsáveis pela caracterização das linhagens celulares, assim como pela sua

distribuição e comercialização, mantendo estoques em condições­padrão e respeitando normas de segurança. Atualmente,

existem bancos de células em todo o mundo que fornecem catálogos de informações dessas linhagens ou apresentam a

disponibilização dessas informações por meio da rede internacional de computadores, como o banco de células americano

American Type Culture Collection (ATCC), o banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ/UFRJ), entre outros. Algumas

das linhagens celulares amplamente utilizadas em pesquisa estão listadas na Tabela 10.1 e ilustradas na Figura 10.2.

Tabela 10.1 Algumas linhagens celulares comumente utilizadas em pesquisa.

Linhagemcelular Origemdo tecido/Tipo celular Patologia

A2780 Ovário/Epitelial (humano) Carcinoma

A549 Pulmão/Epitelial (humano) Carcinoma

DU 145 Próstata/Epitelial (humano) Carcinoma

HepG2 Fígado/Epitelial (humano) Hepatocarcinoma

MCF10A Glândula mamária/Epitelial (humano) Fibrosecística

MCF7 Mama/Epitelial (humano) Adenocarcinoma

MDA-MB-231/ MDA-MB-468 Glândula mamária/Epitelial (humano) Adenocarcinoma

SCC-9/SCC-25 Boca/Epitelial (humano) Carcinoma

SCC-4/SCC-15 Língua/Epitelial (humano) Carcinoma

HCT116 Cólon/Epitelial (humano) Carcinomacolorretal

MDCK 60 Rim/Epitelial (canino) Normal

MDCK 1 Rim/Fibroblasto(canino) Normal

D-17 Osso/Epitelial (canino) Osteossarcoma

CRFK Rim/Epitelial (gato) Normal

CMT-U229 Glândula mamária/Epitelial (canino) Tumor mistobenigno

CF41 Glândula mamária/Epitelial (canino) Carcinoma

HT1080 Tecidoconjuntivo/Epitelial (humano) Fibrossarcoma

HeLa Cérvice/Epitelial (humano) Adenocarcinoma

HEK293 Rim/Epitelial (humano) Normal

Figura 10.2 Imagens de células aderentes em cultivo em monocamada. A. Linhagem tumoral mamária canina, CMT­U229,

cedida pela Dra. Eva Hellmén da Universidade de Uppsala, Suécia. B. Linhagem tumoral mamária canina, CF­41, obtida

pelo banco de células ATCC. C. Cultura primária de fibroblastos provenientes de tecido mamário tumoral canino. D.

Linhagem tumoral mamária humana não metastática, MCF­7, obtida pelo banco de células ATCC. E. Linhagem tumoral

mamária humana metastática, MDA­MB­231, obtida pelo banco de células ATCC. F. Linhagem tumoral mamária humana

não transformada, MCF­10A. G. Linhagem tumoral de fígado humana, HepG2. H. Linhagem tumoral de língua SCC­4. I.

Linhagem tumoral de língua, SCC­15. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer

(LIMC/FAMERP).

Biossegurança em cultivo de células

Para o sucesso da técnica de cultura de células, o cumprimento das regras e os cuidados com assepsia são fundamentais,

uma vez que cerca de 70% dos problemas que surgem estão relacionados com contaminações. Assim, o cultivo de células

deve ser realizado em condições assépticas. Para isso, vários cuidados básicos de manipulação e prevenção devem ser

tomados.

Entre os equipamentos de proteção individual que devem ser obrigatoriamente utilizados para a manipulação das células

em cultivo, estão máscara e luvas cirúrgicas, touca, propés e aventais descartáveis. Além disso, antes de iniciar a

manipulação das células em cultivo, deve­se realizar a higienização simples das mãos com água e sabão e antisséptica com

álcool etílico 70%, seguindo os passos de lavagem estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),

■

desde as unhas e as extremidades dos dedos até o antebraço, com a finalidade de remover a sujidade propícia à permanência

e a proliferação de microrganismos que colonizam as camadas superficiais da pele, assim como o suor, a oleosidade e as

células mortas, reduzindo a carga microbiana das mãos. Ao final, secar as mãos com papel­toalha descartável seguindo

pelos punhos e depois descartar o papel­toalha em depósito de lixo próprio para resíduos comuns e vestir luvas cirúrgicas.

Como medida de segurança, o profissional também não deve usar anéis, pulseiras, relógios, entre outros adereços que

possam entrar em contato com os materiais estéreis utilizados na manipulação das células.

Além disso, toda a superfície da área de trabalho deve ser limpa com álcool etílico 70% antes e após o desenvolvimento

de cada atividade. Assim como todo material aquecido em banho­maria deve passar por assepsia antes de ser introduzido

na cabine de segurança biológica. Deve­se retirar o material do banho­maria, remover o excesso de umidade com auxílio de

uma gaze ou um papel absorvente e realizar posterior limpeza com álcool etílico 70%. O álcool é eficaz na redução da flora

bacteriana da pele por ter propriedade desnaturante de proteínas, responsável por sua ação antimicrobiana.

O cultivo celular deve ser realizado em fluxo laminar ou em cabine de segurança biológica, uma capela para manipulação

de reagentes e substâncias tóxicas e voláteis, com espaço suficiente apenas para colocar os braços dentro. Antes do início

dos procedimentos, a câmara interna do fluxo deve ser limpa com gaze estéril embebida em álcool etílico 70% e o fluxo de

ar e a luz ultravioleta (UV), útil para a eliminação específica de microrganismos no ar e na água, devem ser ligados por, no

mínimo, 30 min antes do uso (Figura 10.3). Todo o material utilizado deve ser desinfetado, autoclavado e esterilizado para

minimizar as chances de contaminação, assim como o uso do fogo dentro do fluxo laminar. Durante a manipulação, a cada

retirada das mãos do espaço interno do fluxo laminar, devem­se friccionar as luvas com álcool etílico 70%. Com esses

procedimentos básicos para a manipulação das células, a chance de contaminação com microrganismos pode ser evitada.

Manutenção celular in vitro

A dissociação das células dos tecidos e a separação de acordo com o tipo celular resultam em uma população celular

relativamente homogênea que pode ser analisada diretamente ou após inúmeras replicações.

Estudos de cultura celular bidimensional são frequentemente realizados em substrato sintético como vidro ou plástico,

forçando as células a ajustarem­se ao plano artificial e à superfície rígida fornecida. As garrafas e os frascos utilizados para

a manutenção de células aderentes têm superfície plana, propriedades ópticas e cargas negativas, são constituídos de

poliestireno, são uniformes quanto às propriedades e à reprodutibilidade, são hidrofóbicos e previamente tratados com

químicos e radiações γ. O estabelecimento da cultura celular exige condições assépticas, regulação de temperatura,

umidade, oxigênio e gás carbônico, bem como meios de cultivo e suplementos específicos.

Condições e meios nutritivos apropriados ao cultivo celular

Para manutenção e propagação das células em cultura, é necessário mimetizar as condições fisiológicas, vias metabólicas e

bioquímicas, reproduzir as condições nutricionais, mimetizar uma atmosfera apropriada, de temperatura, umidade, oxigênio

e gás carbônico encontrados in vivo, além de ter condições de esterilidade com ausência total de microrganismos e agentes

tóxicos. As células devem ser mantidas em incubadoras apropriadas, que controlarão a temperatura geralmente em torno de

36,5°C, ter concentração de CO2 em torno de 5% e manter a umidade do ar controlada.

Em procedimentos rotineiros, como troca de meio, repique e outros, deve­se trabalhar utilizando­se cabine de segurança

biológica, equipamento que possibilita a filtração do ar por um sistema de membranas seriadas com poros de diâmetro que

decrescem gradativamente até 0,3 μm, criando­se assim um local de trabalho no qual o ar que entrará em contato com as

células estará em condições de esterilidade, evitando­se possíveis contaminações. As células são frequentemente

observadas por microscópio invertido de imagem (invertoscópio; Figura 10.4).

Figura 10.3 Cabine de segurança biológica adequada para o desenvolvimento da técnica de cultivo celular. A. Câmara

interna limpa com álcool etílico 70%, fluxo de ar e luz ultravioleta (UV) ligados antes da manipulação das células em

cultivo. B. Cabine de segurança biológica com luz fluorescente acesa e pronta para a utilização. Imagens cedidas pelo

Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

É necessário o fornecimento de nutrientes específicos e em concentrações ideais para as células com o intuito de simular

as condições encontradas no tecido original. Este meio pode ser encontrado na forma em pó, altamente estável, ou, ainda,

em forma líquida. Os meios de cultivo foram estabelecidos a partir de 1950, com diferentes formulações que

proporcionassem a manutenção e o crescimento celular in vitro, como o meio 199 de Morgan de 1950, o meio CMRL de

Parker de 1957, os meios basais de Eagle de 1955 e 1959, e o meio NCTC 109 desenvolvido por Evans et al. a partir de

1956, utilizados até hoje.

Em sua composição, devem conter sais inorgânicos (como cálcio, ferro, magnésio, potássio, entre outros), aminoácidos

essenciais e não essenciais, vitaminas, proteínas, antibióticos, fontes de energia, como a glicose, hormônios ou fatores de

crescimento, condições físico­químicas adequadas, como pH e osmolaridade, para garantir a sobrevivência celular (Figura

10.5). Antibióticos e fungicidas são utilizados nos meios nutritivos para controle da contaminação microbiológica, sendo

os compostos mais utilizados a gentamicina, a estreptomicina, a penicilina e a anfotericina.

Em acréscimo, os meios de cultivo geralmente são suplementados com 5% a 20% de soro. Este aditivo fornece

elementos essenciais ao meio de uma forma empírica, contendo: fatores de crescimento, como insulina, fator de

crescimento epidermal (EGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), que estimulam o crescimento e a

diferenciação celular, prevenindo assim os processos de apoptose; albumina, com a função de proteger as células de

choques físicos decorrentes dos processos de pipetagem e ainda como agente desintoxicante; fatores de adesão celular;

transportadores de íons de ferro, como a transferrina; além de fatores protetores (inibidores de proteases). Deve­se utilizar

um soro fetal certificado, estéril, inativado a 56°C por 30 min, livre de micoplasmas e sem endotoxinas. Os soros estão

disponíveis comercialmente, e os mais utilizados são de origem bovina, equina e humana.

A formulação dos meios de cultivo e dos suplementos utilizados varia de acordo com a origem celular a que se destina,

podendo ser adaptada a cada tipo celular. Para a escolha do meio de cultivo adequado a cada célula, é necessário que se

façam uma minuciosa consulta literária e uma busca de referências em bancos oficiais de células. Como exemplo, é

possível citar os meios BME (basal medium Eagle’s), EMEM (essencial minnimun with Earl’s salts medium), DMEM

(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, meio sintético complexo), RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial

Institute, meio sintético complexo), CMRL (basal medium designed for serum­free formulations), D­22 (basal medium for

insect cell culture) e HAM­F12 (F­12 nutrientmedium).

Figura 10.4 Esquema ilustrativo da cabine de segurança biológica (A), invertoscópio (B) e incubadora de CO2

(C) para

manutenção do cultivo celular. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

Após acréscimo de quaisquer substâncias ao meio celular, é importante rotular o frasco imediatamente, com etiquetas

que contenham informações sobre a solução preparada, o lote, a data do preparo, o prazo de validade, o nome dos técnicos

responsáveis e a temperatura de estocagem, que deve ser preconizada entre 4 e 8°C.

Principais agentes contaminantes

Manter a assepsia em cultura é algo muito difícil. O material esterilizado erroneamente, a manipulação sem cuidado e,

principalmente, a falta de higiene e de vestimenta correta dos manipuladores podem causar contaminação de uma cultura.

Embora a contaminação microbiana seja a mais comum, quando as condições de cultura já estão estabelecidas, pode

ocorrer também a contaminação química, principalmente quando se utiliza lavagem de vidrarias e materiais com água de

qualidade não apropriada. Além disso, também pode ocorrer a chamada contaminação cruzada, que é a contaminação entre

células de linhagens diferentes. A contaminação microbiana leva à perda das culturas celulares em andamento e geralmente

ocorre em razão de erros de manipulação durante a interação do pesquisador com as técnicas e condições de cultura.

Diferentes tipos de agentes podem causar a contaminação microbiana: bactérias, vírus, fungos (Figura 10.6), leveduras,

protozoários e micoplasmas.

Figura 10.5 Componentes básicos constituintes do meio de cultivo celular. CaCl2 = cloreto de cálcio; KCl = cloreto de

potássio; MgS = sulfeto de magnésio; NaCl = cloreto de sódio; NaH2PO4 = fosfato monossódico; NaHCO3 = bicarbonato de

sódio.

As bactérias são organismos procariontes com capacidade de proliferação muito rápida e que, na maioria das vezes,

conseguem crescer em qualquer condição. Elas estão presentes no ar e nas superfícies. As contaminações por bactérias e

fungos são geralmente fáceis e rapidamente detectadas em virtude da turvação do meio de cultura, da alteração do pH pela

capacidade de metabolizar o meio de cultura tornando­o excessivamente ácido, da rápida morte celular e da presença de

partículas em suspensão. Assim, uma contaminação bacteriana inviabiliza a utilização da cultura celular, visto que elas

competem pelos nutrientes do meio fazendo com que as células morram por causa da falta de alimento, alterando o

metabolismo celular e diminuindo consequentemente a viabilidade. A presença de micélios filamentosos de fungos é

facilmente observada em um frasco de cultura.

Micoplasmas são microrganismos procariotos desprovidos de parede celular que contêm uma membrana lipídica em

bicamadas, imperceptíveis na visualização por microscópio óptico invertido, sendo os contaminantes mais comuns na

cultura de células. As contaminações por vírus e micoplasmas geralmente ocorrem de forma mais lenta, podendo apresentar

período variável de latência, com diminuição gradativa do crescimento celular até a perda das culturas. No caso dos vírus,

às vezes é possível a observação de regiões de morte celular nas culturas, enquanto nos micoplasmas a detecção visual da

contaminação não é possível. Para diagnóstico de contaminação por esses agentes, existem testes que utilizam a

imunofluorescência ou a marcação de proteínas específicas.

Em casos de contaminação, é importante fazer a rastreabilidade, avaliando as condições e o ambiente nos quais a célula

foi cultivada, os meios e as soluções utilizados e a paramentação do pesquisador responsável pela manipulação e a revisão

das técnicas e dos procedimentos. Isso impede que, em caso de contaminação pontual, esta se espalhe para outras culturas

do laboratório, além de permitir a investigação dos principais motivos da contaminação, a fim de eliminá­la. Nesse sentido,

a esterilidade deve ser garantida por meio da qualidade das soluções e do material utilizado e do bom treinamento dos

técnicos.

Tripsinização celular

Após determinado tempo em cultivo, as células estabelecem contato umas com as outras e os nutrientes disponíveis para a

manutenção das células podem não ser mais suficientes para a densidade celular. Assim, há necessidade de proceder

subculturas sucessivas. O primeiro passo no isolamento de células individuais é romper a matriz extracelular e as junções

entre as células que as mantêm unidas. Com esse propósito, um tecido normalmente é tratado com enzimas proteolíticas

(como tripsina e colagenase) para digerir as proteínas na matriz extracelular e com agentes (como o ácido

etilenodiaminotetracético, ou EDTA) que ligam ou quelam o Ca

2+

, do qual a adesão entre as células depende.

O processo de renovação de células de uma garrafa a outra é chamado passagem. O número de passagens se refere ao

número de vezes que essa cultura foi subcultivada. Muitas linhagens contínuas são capazes de manter as características

iniciais do tecido original com algumas passagens, enquanto as células transformadas não mantêm as mesmas

características e são capazes de permanecer em cultura por um grande número de passagens (chegando até virtualmente ao

infinito número de passagens).

Para as células não aderentes, o procedimento de passagem se assemelha a uma diluição, e basta retirar células da garrafa

de cultivo, adicionando novo meio ao seu lugar. Isso ocorre porque essas células se encontram em suspensão no meio,

sendo possível retirá­las sem que seja necessário um procedimento específico.

Para as células aderentes, são necessários processos de dissociação mecânica (raspadores) ou enzimática (por ação da

tripsina) para estabelecimento de nova cultura celular. A desagregação mecânica pode ser feita por compressão das células

contra uma peneira com malha de diâmetro sucessivamente menor, passando as células por meio de uma seringa e uma

agulha ou simplesmente pipetando repetidamente. Esta técnica tem a vantagem de ser mais rápida do que a dissociação

enzimática, embora cause mais lesões mecânicas às células.

A desagregação enzimática ocorre pela digestão das proteínas de adesão por proteases, ocasionando a dissociação da

matriz e a quebra das proteínas de contato célula/célula, sem comprometer a membrana ou danificar a superfície celular. A

tripsina, enzima proteolítica inespecífica, hidrolisa cadeias polipeptídicas nos radicais lisil­arginil, formando terminações

de clivagem, éster e amida, desestruturando assim a matriz, obrigando as células a restabelecerem os rearranjos do

citoesqueleto. Sua atividade residual pode ser neutralizada por intermédio do soro do meio de cultura ou por meio de um

inibidor sintético adicionado.

Figura 10.6 Esquema ilustrativo de garrafa de explante celular em cultivo. A. Cultivo primário livre de contaminação. B.

Cultivo primário com contaminação fúngica. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer

(LIMC/FAMERP).

Contagem celular em hematímetro de Neubauer

A viabilidade celular e as condições de crescimento são controladas por meio da quantificação celular; além disso, diversos

experimentos necessitam de número preciso de células para novo plaqueamento. A forma direta de contagem de células

consiste na contagem direta no frasco de cultivo, e a forma indireta é feita por quantificação de determinadas estruturas

celulares, como proteínas ou medição do metabolismo celular.

O método mais utilizado na quantificação direta é a contagem em câmara de Neubauer. A câmara de Neubauer é uma

lâmina de vidro com divisões que auxiliam na contagem; ela contém 9 quadrados que medem 1 mm

2 de área, e somente os

quatro quadrados externos são utilizados na contagem de células. Cada quadrado externo é formado por mais 16 quadrados

menores que auxiliam a contagem (Figura 10.7 A). É necessário acoplar uma lamínula de vidro sobre a câmara, a fim de

conter a suspensão celular; o espaço formado entre a lamínula e a câmara é de 0,1 mm. Dessa forma, o volume

determinado por cada quadrado é equivalente a 0,1 mm

3 e as células contadas em um quadrante, ressuspensas em 1 mℓ de

meio de cultivo, equivalem ao valor de células contado, multiplicado por 10